TECNOLOGIA DEL DNA RICOMBINANTE

Crediti: 
6
Settore scientifico disciplinare: 
BIOLOGIA MOLECOLARE (BIO/11)
Anno accademico di offerta: 
2016/2017
Semestre dell'insegnamento: 
Primo Semestre
Lingua di insegnamento: 

Italiano

Obiettivi formativi

Il corso si propone di introdurre le tecniche di base di biologia molecolare
utilizzate nell'isolamento e clonaggio di geni, e nella espressione di
proteine ricombinanti in un ospite batterico

Prerequisiti

No

Contenuti dell'insegnamento

Durante il corso verranno affrontati i seguenti argomenti:
1. Enzimi· Enzimi di Restrizione· Metilazione del DNA· Ligasi· DNA polimerasi· Trascrittasi Inversa (DNA polimerasi RNA dipendente)· Terminal Transferase· RNA polimerasi· Polinucleotide kinasi del fago T4· Fosfatasi alcaline· Nucleasi

2. Elettroforesi su gel · Elettroforesi su gel di agarosio· Recupero del DNA dal gel· Elettroforesi su gel di poliacrilamide · Recupero del DNA dal gel.

3. Clonaggio di singoli geni. Batteri· Terreni di crescita· Genotipo· Conservazione e propagazione. Plasmidi batterici· Replicazione e Incompatibilità· Mobilità· Marcatori di Selezione· Sviluppo dei plasmidi come vettori di clonaggio· Purificazione del DNA e dell’RNA· Determinazione della concentrazione e della purezza. Estrazione e purificazione del DNA plasmidico dai batteri· Digestione con enzimi di restrizione· Purificazione dei prodotti di digestione · Ligazione· Trasformazione dei batteri· Identificazione delle colonie batteriche contenenti plasmidi ricombinanti· Identificazione del ricombinante di interesse· Amplificazione e conservazione dei cloni e librerie plasmidiche.

4. Costruzione ed analisi di librerie. Vettori ad alta capacità usati per librerie· Batteriofagi lambda· Cosmidi· Batteriofagi filamentosi a singolo filamento· Fagemidi· Analisi e clonaggio di DNA genomico eucariotico· Isolamento di DNA genomico eucariotico· Frammentazione del DNA genomico· Dimensione di una libreria genomica· Costruzione ed analisi di librerie a cDNA. Estrazione e purificazione dell’RNA· Preparazione dei materiali e delle soluzioni utilizzati nelle estrazioni di RNA· Metodi classici di estrazione· Separazione del Poli(A)+RNA. Dimensioni di una libreria di cDNA· Sintesi del primo filamento del cDNA· Sintesi del secondo filamento del cDNA· Clonaggio del cDNA in un vettore· Screening di una libreria· Screening mediante ibridazione di acidi nucleici· Screening immunologico· Screening funzionale· Screening per interazione.

5. Sintesi in vitro di DNA. Sintesi artificiale di DNA. PCR· Componenti essenziali della PCR· Fasi termiche della PCR· Progettazione dei primer· Problema delle contaminazioni· Hot start · Analisi per elettroforesi su gel· Clonaggio degli ampliconi· Nested PCR· Long PCR· Reverse Transcriptase-PCR (RT-PCR)· Touchdown PCR. Mutagenesi per PCR.

6. Sequenziamento· Metodo di Sanger · Sequenziamento automatico · Sequenziamento di prodotti di PCR · Sequenziamento di frammenti di DNA lunghi e di interi genomi.

7. Produzione di proteine ricombinanti. Trascrizione di proteine ricombinanti · Regolazione della trascrizione di proteine ricombinanti · Traduzione e stabilità proteica · Vettori · Purificazione della proteina ricombinante.

Bibliografia

Dai geni ai genomi - Dale, von Schantz - EdiSES
Analisi dei geni e genomi - Richard J.Reece - EdiSES
Ingegneria genetica. Principi e tecniche. S.Primrose et al. - Zanichelli
DNA Ricombinante - J.D.Watson et al. - Zanichelli
Biotecnologie Molecolari. Principi e tecniche -Terry A.Brown - Zanichelli

Metodi didattici

Lezione orale

Modalità verifica apprendimento

Esame scritto